EVALUACIÓN,
CRIOPRESERVACIÓN DE SEMEN E INSEMINACIÓN ARTIFICIAL EN EL GATO DOMÉSTICO
Stornelli, M.C1.; Stornelli, M.A1
1-Cátedra de Reproducción Animal. Laboratorio Central. Fac. Cs. Vet. U.N.L.P. Calle 60 y 118. La Plata (1900). Bs. As. Argentina.
E-mail: astornel@fcv.medvet.unlp.edu.ar
Introducción
La evaluación de semen en el macho
reproductor es un método complementario de rutina en la evaluación del gato
infértil o con enfermedad del tracto reproductivo, así como en la
criopreservación de semen.
En el gato la recolección de semen
puede realizarse mediante vagina artificial o electroeyaculación. El eyaculado
obtenido puede utilizarse para evaluar la calidad de semen de un reproductor,
criopreservación de semen o inseminación artificial (IA). La recolección de
semen a partir de la vagina de la hembra luego del servicio natural, permite
obtener algunos datos sobre el semen de un reproductor. Si bien esta
información puede ser útil es escasa en comparación con la proporcionada por la
contrastación de un eyaculado obtenido mediante vagina artificial o
electroeyaculación. La recolección de espermatozoides de la cola del epidídimo
es un método implementado para la criopreservación de semen pos mortem.
La
criopreservación de semen e inseminación artificial en el gato doméstico pueden
utilizarse como reservorio genético y posibilidad de reproducción asistida, así
como modelo experimental para felinos silvestres en vías de extinción. Los
bancos de semen reducen la necesidad de machos en un plantel reproductivo y
permiten preservar material genético que de otra forma se perdería. Así mismo
el estudio de la reproducción de los gatos domésticos constituye un modelo
experimental sumamente útil para el estudio e investigación de especies
silvestres.
Recolección de semen
La electroeyaculación es el método
más utilizado para la recolección de semen, sin embargo la vagina artificial puede
utilizarse en algunos gatos entrenados. Otros métodos pueden ser útiles cuando
no es posible aplicar los anteriormente mencionadas.
Obtención de semen
mediante vagina artificial:
Puede
fabricarse una vagina artificial, seccionando y adaptando una pera de goma
pequeña (como las que acoplamos a las pipetas de 1 o 2 mililitros) a un
ependorf o a un tubo de pequeño calibre (15). Foto 1 y 2
La vagina debe precalentarse a 36ºC, colocarse
cuando el macho realiza la monta de la hembra en celo y colectar así el
eyaculado. La colecta puede realizarse sin utilizar una hembra en celo, previo
entrenamiento del macho a la eyaculación mediante manipulación. Sin embargo es
preciso recordar que cualquiera sea el método elegido, el animal requiere un
entrenamiento previo y solo un pequeño porcentaje de los animales logra
eyacular mediante la utilización de vagina artificial (2).
Obtención de semen
mediante electroeyaculación:
L
a electroeyaculación permite obtener semen de todos los animales que posean la
vía neurológica implicada intacta. Sin embargo, una limitante es la necesidad
de someter al animal a una anestesia general a fin de evitar las molestias que
este método produce sobre el mismo (6)
Para
la realización de esta técnica debe utilizarse un electroeyaculador, el cual
consta de un vástago (fuente de electrodos) y una fuente de voltaje (foto 3).
El vástago es introducido entre 7 y 9 centímetros en el recto con los electrodos ubicados hacia ventral.
El pene es exteriorizado y se lo coloca dentro de un tubo. Se necesitan unos 80
estímulos de entre 2 y 5 voltios para lograr un eyaculado. Los estímulos se
dividen en tres series con un descanso de 2 a 3 minutos, entre cada serie. Con
cada estímulo ocurre una extensión rígida de los miembros posteriores, la cual
indica que el estímulo ha sido adecuado (2, 15). Se ha demostrado que el
voltaje de estimulación afecta la osmolalidad y pH del semen obtenido por este
método (9). También se ha comprobado que la electroeyaculación permite obtener
un eyaculado de mayor volumen pero menor concentración espermática que la
vagina artificial (9).
Este
método se reserva solo para animales sanos, para los cuales el procedimiento
implica un riesgo mínimo.
Obtención de semen
mediante lavaje vaginal pos servicio:
Si bien este no es el método ideal
para realizar una evaluación seminal, puede utilizarse cuando no es posible
realizar una extracción de semen mediante vagina artificial y es riesgoso
someter al animal a un protocolo anestésico o el propietario no accede al
mismo.
Es preciso considerar que esta
práctica es engorrosa ya que el macho debe realizar un servicio e
inmediatamente después la hembra debe ser sedada para implementar un lavaje
vaginal, el cual se realizará con solución salina fisiológica a 37ºC (15). Debe
considerarse que los espermatozoides recolectados por este método pueden sufrir
alteraciones relacionadas con la técnica de toma de muestra utilizada. El
lavaje vaginal con 1 ml de solución fisiológica permite obtener entre 40 X 104
y 10 X106 espermatozoides (2, 15).
Recuperación de
espermatozoides de la vejiga:
Se ha reportado que el gato eyacula
entre 15 y 90 % de semen en forma retrógrada en la vejiga urinaria. Es así que
la recuperación de espermatozoides de la vejiga es usado para determinar si el
gato produce espermatozoides. (15)
Colección de semen a
partir del epidídimo:
Pueden obtenerse espermatozoides de
la cola del epidídimo luego de la castración o pos mortem. El epidídimo debe
lavarse con un diluyente de semen para obtener los espermatozoides que serán
posteriormente criopreservados.
Este
es un método útil y eficaz en la preservación de semen de especies silvestres
cuando los animales mueren en zoológicos o reservas (3,4).
Evaluación de semen:
Volumen: el volumen del eyaculado es pequeño y varía
según el método utilizado para su obtención. Cuando la recolección se realiza
con vagina artificial el volumen puede alcanzar 0,12 ml, mientras que con
electroeyaculación pueden obtenerse hasta 0,74 ml. El volumen eyaculado puede
medirse utilizando micropipetas (9)
Color: el color es blanquecino, pudiendo
ser amarillo si se contamina con orina y rosado o rojizo si se contamina con
sangre (10)
Concentración espermática: puede oscilar de 13 X106 a 153 X106 espermatozoides
totales.
La
concentración espermática es mayor cuando se colecta la muestra con vagina
artificial en comparación con las muestras obtenidas por electroeyaculación (1,
21). Los métodos de conteo son los usados rutinariamente en la contrastación de
semen (cámara de Neubauer, cámara de Burker y contadores celulares) (2)
Motilidad individual: el porcentaje de motilidad
progresiva se estima en platina térmica, a través de la observación de una gota
de semen puro a 400 X. Se ha comunicado como normal una motilidad progresiva de
entre 60 y 90 % (3, 15)
Morfología
espermática: el espermatozoide felino mide aproximadamente 26 um de
largo a diferencia del canino que mide 36 um (1, 2)
La identificación de formas
anormales se realiza mediante microscopía de contraste de fase o mediante
tinciones como Diff-Quik. Se ha comunicado que el semen normal posee alrededor
del 70 % formas normales. Las anormalidades morfológicas que han sido
identificadas son: macrocefalia, microcefalia, cabeza doble, gota citoplasmática
proximal y distal, cabezas sueltas, colas enrolladas. (15).
Muchos factores influencian la
morfología de los espermatozoides en el eyaculado. Se ha establecido como
normospérmico al semen felino que posee más del 60% de espermatozoides normales.
No se conoce la relación entre morfología espermática y fertilidad in vivo en
gatos (13, 14)
Osmolalidad: es aproximadamente de 320 mOsm (16, 19)
PH: oscila entre 6,6 y 8,8 (16, 19)
Fosfatasa alcalina: el semen felino es rico en fosfatasa
alcalina (16, 19)
Microbiología seminal: las bacterias aeróbicas aisladas a
partir de eyaculados provenientes de gatos sanos incluyen: E coli, Pseudomona Aeruginosa, Proteus Mirabilis, Klebsiella SP,
Streptococo y Stafilococo. Estas
bacterias constituyen la flora saprofita de la uretra distal y prepucio del
macho (6, 12)
Criopreservación de semen
felino:
El semen felino puede ser almacenado
por cortos períodos (24-48hs) mediante refrigeración a 4º C o por largos
períodos mediante congelación. La mayoría de los estudios sobre
criopreservación de semen han sido realizados in vitro. Existen muy pocas
comunicaciones de preñeces logradas mediante inseminación artificial con semen
refrigerado o congelado.
Semen refrigerado: Se han usado,
para la refrigeración de semen felino, diluyentes en base TRIS con el agregado
de yema de huevo, sin embargo pocos estudios han sido realizados sobre los
diferentes diluyentes que pueden usarse en este procedimiento.
La supervivencia espermática y capacidad
fecundante del semen refrigerado han sido estudiadas solo in vitro. Faltan aún
pruebas de campo que comprueben la capacidad fecundante del semen refrigerado a
través del logro de preñeces obtenidas mediante inseminación artificial (15)
Semen congelado: el semen felino
ha sido congelado con diluyentes compuestos por trealosa, glicerol, yema de
huevo y antibióticos. La congelación seminal se ha realizado en pastillas y
pajuelas, lográndose mejores resultados con estas últimas (1, 2, 20).
Luego de un período de equilibración a 5º C de
entre 30 y 40 minutos se realiza la congelación mediante vapores de nitrógeno
líquido y posterior inmersión de las pajuelas en el mismo. Estudios más
profundos sobre congelación de semen felino son necesarios para optimizar el
método (2, 15)
Inseminación artificial
La inseminación artificial (IA) en
los gatos domésticos ha sido implementada principalmente como parte de
proyectos de investigación, donde el gato es usado como modelo experimental
para el estudio de felinos salvajes. Las técnicas de IA y conservación de semen
pueden se una herramienta valiosa en los programas reproductivos felinos. El
semen congelado puede utilizarse como reservorio de material genético y puede
emplearse luego de que un animal haya sido castrado o haya muerto. El sitio en
que se deposita el semen, el momento en que se realiza la inseminación y el
número de espermatozoides mótiles y viables son factores importantes que
influencian la tasa de concepción (22, 10)
En
la hembra felina la ovulación es inducida por el estímulo coital, el cual
desencadena la liberación de GnRH desde el hipotálamo provocando la liberación
de LH a partir de la pituitaria (11, 18). Múltiples coitos son necesarios para
que exista una alta probabilidad de que la hembra ovule. Entre 26 y 30 hs luego
de la liberación de LH (si las concentraciones séricas de la misma son
suficientes) ocurre la ovulación de todos los oocitos maduros (10, 15). Se
estima que en un pequeño porcentaje de hembras (35%) ocurre ovulación
espontánea (10). En relación a la fisiología felina, para realizar IA debe
inducirse la ovulación. Este evento fisiológico puede provocarse mediante la
administración de gonadotrofina coriónica humana (hCG), la cual posee actividad
LH (2, 18) Ocurre la ovulación en la mayoría de las hembras, cuando se
administran 100 UI de hCG intramuscular el tercer día del estro. Una
alternativa es el uso de 25 ug de GnRH, hormona liberadora de gonadotrofina,
por vía intramuscular (5, 7, 8, 17).
Es importante destacar que se
encuentra en amplio desarrollo mediante continuas investigaciones un protocolo
eficiente para la inducción hormonal del estro y ovulación con mínimos efectos
colaterales.
Inseminación
artificial con semen fresco:
Se han comunicado preñeces con IA
vaginal o uterina con semen fresco. El semen, debido al escaso volumen
eyaculado, puede diluirse con solución fisiológica o un diluyente en base Tris.
Esto permite un mejor manejo del eyaculado, el cual será depositado en la
vagina 24 hs después de la ovulación o en el útero 30 a 50 minutos luego de
ocurrida la misma (2, 22)
Para la IA vaginal puede utilizarse
una sonda tomcat, la cual será introducida en la vagina, la mayoría de las
veces, sin utilización de tranquilizante. El semen será depositado en el fondo
de la vagina cerca del cuello del útero (foto 4). Deben calcularse un mínimo de
80 X 106 espermatozoides para la inseminación intravaginal, lo cual
es 10 veces más alto que lo necesario para la IA intrauterina. (23)
Inseminación
artificial con semen congelado:
La primer comunicación de una preñez
con semen congelado en gato se realiza en 1976 a partir de IA intravaginal (20)
La tasa de preñez esperada
utilizando semen congelado mediante IA intravaginal es aproximadamente de 10 %.
La pobre fertilidad observada cuando utilizamos semen congelado se relaciona
con el daño sufrido por los espermatozoides durante el proceso de congelación y
descongelación (2). El método y lugar de IA son cruciales cuando se utiliza
semen congelado. La IA intrauterina permite obtener tasas de preñez superiores
en comparación la IA vaginal (16)
Conclusiones:
La reproducción felina ha captado la
atención de numerosos científicos en la última década. El creciente interés
sobre este área del conocimiento se relaciona no solo con las implicancias que
tiene sobre la medicina y reproducción del gato doméstico, sino también con la
posibilidad de utilización del Felis
catus como modelo para el estudio de felinos silvestres. El desarrollo de
la fecundación in vitro y la transferencia embrionaria ha impulsado la
actualización de conocimientos de la fisiología reproductiva felina,
realizándose importantes descubrimientos lo cual ha estimulado el desarrollo de
la IA y la criopreservación de semen. La difusión del conocimiento en este área,
permitirá al especialista en medicina felina, incluir en su práctica diaria
procedimientos nuevos relacionados con la reproducción y biotecnología.
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